摘要 從細胞凋亡的分子機制來分析細胞凋亡與胰腺炎之間的關(guān)系，并簡要綜述實驗性胰腺炎的凋亡誘導治療

　　近年的研究證實細胞凋亡參與胰腺炎的病理生理過程，但要從本質(zhì)上闡明細胞凋亡與胰腺炎之間的關(guān)系應從細胞凋亡的分子機制來進行研究?，F(xiàn)在認為細胞調(diào)亡參與胰腺炎發(fā)病主要有兩種機制：一類是受基因調(diào)控；另一類則是非基因調(diào)控。

　　1基因調(diào)控

　　受基因調(diào)控的細胞調(diào)亡又稱為程序性細胞死亡。一般分為兩類：一類是直接調(diào)控，如癌基因；另一類則是間接調(diào)控。如生物活性分子，通過誘導癌基因的表達發(fā)揮調(diào)控作用。

　　癌基因中bc1-2基因家族是zui受關(guān)注的與細胞凋亡相關(guān)的基因之一。Wada等[1]對胰管結(jié)扎（PDL）鼠應用抗bc1-2單克隆抗體和抗增殖細胞核抗原（PCNA）單克隆抗體以免疫印跡和免疫組化方法對bc1-2和PCNA進行檢測。結(jié)果顯示，PDL鼠胰腺導管上皮細胞的bc1-2表達在第四、五天高于對照組2~5倍。bc1-2和PCNA免疫染色在對照組的胰腺導管上皮為微弱的染色，而在PDL鼠胰腺導管皮bcl-2和PCNA免疫染色陽性細胞數(shù)量增加，分別在第二天和第三天達zui高值。該結(jié)果表明，bc1-2具有抑制胰腺導管上皮細胞凋亡的功能。為進一步研究bc1-2基因家族中各基因的作用，Miyamoto等[2]研究PDL和雨蛙肽誘導急性胰腺炎兩種鼠實驗模型和人慢性阻塞性胰腺炎（COP）胰腺外分泌細胞bc1-2家族相關(guān)基因的表達。結(jié)果顯示，在正常胰腺未見bc1-2基因家族表達；在PDL組胰管結(jié)扎后1天在胰腺細胞即觀察到bax和bc1-x表達，且在第二、三天尤為顯著，而其時胰腺腺細胞也發(fā)生凋亡。同時導管細胞增加形成導管管狀復合體，導管細胞內(nèi)bc1-2、bc1-x染色增加并在第五天達zui大值。鼠急性胰腺炎模型注射雨蛙肽后8小時和48小時發(fā)現(xiàn)胰腺細胞凋亡，同時應用免疫組化方法觀察到胰腺細胞中存在 bax和bc1-x表達。COP時導管管狀復合體導管細胞bc1-2、bc1-x、mc1-1染色陽性，但bax染色陰性。上述結(jié)果表明，在兩種鼠胰腺炎模型中胰腺細胞內(nèi)bax誘導細胞調(diào)亡；而bc1-2、mc1-1可能在防止導管細胞凋亡和形成導管管狀復合體中起作用；bc1-x有既可誘導又可抑制細胞凋亡的雙重作用。雖然許多實驗證明bc1-2基因家族在胰腺細胞凋亡中發(fā)揮重要作用，但其作用機制尚未*闡明。

　　癌基因中另一個與細胞凋亡相關(guān)的基因是被稱為“基因組衛(wèi)士”的野生型p53。Maacke等[3]在行ERCP時收集了27例慢性胰腺炎病人胰液細胞學標本，并應用一系列p53特異性單抗PAb1620、PAb1801、PAb240及CM-1（人重組p53多克降抗血清）以免疫過氧化酶染色觀察p53表達情況，同時以TUNEL法檢測調(diào)亡細胞。結(jié)果示，27例慢性胰腺炎病人中有16例（59%）p53蛋白表達陽性，11例PAb1620表達陽性，同時發(fā)現(xiàn)有凋亡細胞?？赡艿臋C制是慢性胰腺炎時氧自由基和一氧化氮基團損傷DNA。p53表達增加可能是DNA損傷的結(jié)果，并在DNA損傷的基礎(chǔ)上誘導細胞調(diào)亡。有人認為野生型p53提高細胞內(nèi)bax蛋白表達使得bc1-2/bax比例失衡而促進細胞凋亡[4]。

　　在基因調(diào)控與細胞凋亡關(guān)系的研究中，另一熱點課題是一些間接調(diào)控細胞凋亡的生物活性分子，如轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）β、腫瘤壞死因子（TNF）等。zui近，Subramanian等[5]從源于人中胚層的成骨細胞中識別一種TGF-β調(diào)控的鋅指編碼基因的TIEG（TGF-β誘導的早期基因）與胰腺炎細胞凋亡有關(guān)。為進一步研究TGF-β在胰腺外分泌細胞群中的表達、功能及其調(diào)控機制，Tachibana等[6]對培養(yǎng)的鼠胰腺AR42J細胞和人五種胰腺外分泌細胞PANC1、MIAPaCa2、BxPC3、HST66T和Capan1進行免疫印跡分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在這六種外分泌細胞中均有豐富的TIEG mRNA表達。應用純化的TIEG親和抗體進行定位檢查發(fā)現(xiàn)TIEG存在于正常人胰腺外分泌部導管和腺細胞群。研究還發(fā)現(xiàn)，經(jīng)TGF-β處理上述細胞2小時后可見TIEG表達上調(diào)。為進一步觀察TIEG的表達增加是否誘導胰腺外分泌細胞凋亡，用5ng/ml tGF-β1處理PANC1細胞24小時、48小時和72小時，結(jié)果顯示，在任一時間點TGF-β1都增加凋亡率，尤以72小時后為zui甚。為進一步證實TIEG表達具有增加誘導凋亡功能，還進行了轉(zhuǎn)染實驗。用10μg表達TIEG載體（pMEX-neo-TIEG）轉(zhuǎn)染PANC1細胞和僅轉(zhuǎn)染對照載體（pMEX-neo）的PANC1細胞及未轉(zhuǎn)染細胞進行研究。MTS增殖分析結(jié)果示，未轉(zhuǎn)染細胞和pMEX-neo細胞生長正常；pMEX-neo-TIEG細胞增殖停止，而且72小時后pMEX-neo-TIEG細胞量較實驗初低。DNA梯形圖譜分析表明，pMEX-neo-TIEG細胞凋亡數(shù)在任一時刻均超過30%，而且還發(fā)現(xiàn)pMEX-neo-TIEG細胞凋亡率比TGF-β1處理的PANC1細胞凋亡率高，這可能是觀察到的TGF-β1處理的PANC1細胞TIEG上調(diào)是瞬時的，而pMEX-neo-TIEG細胞內(nèi)的TIEG上調(diào)則是穩(wěn)定的。因此，TGF-β誘導的TIEG表達增加可誘導細胞凋亡。

　　還有一些資料表明，TNF是介導細胞凋亡的介質(zhì)[7]，可能的機制是TNF激活T細胞表達Fas配體，F(xiàn)as配體再與靶細胞結(jié)合促使靶細胞凋亡。

　　不僅TGF-β、TNF這些因子通過誘導癌基因表達發(fā)揮調(diào)控作用，而且一些生物活性物質(zhì)也有類似的機制。有學者報道，用維生素K3和超過生理濃度的雨蛙肽（＞10-10M）[8]和用低濃度peroxynitrite（2~5μM）[9]分別培養(yǎng)鼠胰腺AR42J細胞，結(jié)果均可觀察到細胞凋亡現(xiàn)象，且發(fā)現(xiàn)野生型p53表達增加。上述結(jié)果表明，一些生物活性物質(zhì)可能通過野生型p53表達增加誘導細胞凋亡。

　　2非基因調(diào)控

　　近年來，盡管有關(guān)蛋白質(zhì)和RNA合成抑制劑抑制凋亡研究已證實蛋白質(zhì)大分子合成是凋亡的另一重要生化特征，同時證實細胞凋亡是一種由內(nèi)在基因編碼調(diào)控的細胞死亡方式[10]。但也有Fas介導細胞凋亡不依賴蛋白質(zhì)合成的報道[11]。一些損傷因子直接或間接損傷DNA而致細胞凋亡，如缺血再灌注等。這些現(xiàn)象表明凋亡除受基因調(diào)控外還受非基因調(diào)控。

　　Fujimoto等[12]用血管鉗鉗夾鼠胰腺下方的脾動脈1小時后再松開血管鉗造成選擇性胰尾部缺血再灌注的實驗模型，然后用DNA凝膠電泳方法觀察細胞凋亡情況，結(jié)果在缺血再灌注后48小時觀察到胰腺細胞凋亡的典型DNA梯形圖譜。該實驗表明，缺血再灌注可誘導胰腺細胞凋亡，但其機制尚不太清楚。

　　盡管從凋亡的分子機制研究凋亡與胰腺炎關(guān)系取得了一些進展，但仍需進一步闡明凋亡在胰腺炎中的確切作用機制，從而使之應用于臨床實踐。

　　新近，Matsuzaki等[13]研究發(fā)現(xiàn)，在雨蛙肽誘導的急性胰腺炎的急性階段很少觀察到細胞凋亡，但在急性期后恢復階段則見大量細胞凋亡。而Tanaka等[14]研究觀察到，在不同的慢性胰腺炎實驗模型中顯示凋亡的顯著性。這些結(jié)果表明，細胞凋亡可能是胰腺炎病理生理中的一個環(huán)節(jié)，可能使胰腺炎向好的方向發(fā)展，亦可能使病情惡化。

　　3實驗性胰腺炎的凋亡誘導治療

　　Kaiser等[15]報道，在五種急性胰腺炎模型中急性胰腺炎嚴重程度與凋亡呈負相關(guān)現(xiàn)象，即在阻塞鼠膽胰共同通路和輸注大劑量雨蛙肽誘導的輕度胰腺炎中可觀察到細胞凋亡，而在阻塞負鼠膽胰共同通路和年幼雌鼠CDE飲食（無膽堿而乙硫氨酸充足的食物）誘導的重癥胰腺炎則觀察到壞死。凋亡與胰腺炎嚴重程度呈負相關(guān)，表明細胞凋亡可能是對胰腺損傷的有利反應。zui近有研究提出，誘導細胞凋亡可減輕胰腺炎的嚴重程度。Saluja等[16]報道，在細胞凋亡存在條件下可減輕雨蛙肽誘導的胰腺炎嚴重程度。給予實驗鼠5周大豆飲食后轉(zhuǎn)為正常飲食27小時，然后重復注射超大劑量雨蛙肽50μg·kg-1·h-1共12小時誘導胰腺炎，對照組給予5周正常飲食后注射同樣劑量的雨蛙肽誘導胰腺炎。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在5周大豆飲食繼而轉(zhuǎn)為正常飲食后，原來肥大的胰腺腺體迅速縮小，并且觀察到縮小期間伴有大量的腺細胞凋亡，在縮小期間注射雨蛙肽誘導的胰腺炎炎癥程度為2+，而對照組炎癥為4+（4+表示廣泛的炎癥，0表達無炎癥）。結(jié)果表明，在腺細胞凋亡時注射雨蛙肽，可減輕其誘導的胰腺炎嚴重程度。為進一步證實上述結(jié)果，Kaiser等[10]在結(jié)扎鼠膽胰共同通路誘導胰腺炎后給予蛋白質(zhì)合成抑制劑環(huán)已酰亞胺以抑制細胞凋亡，結(jié)果發(fā)現(xiàn)抑制細胞凋亡后加重胰腺炎病變程度。另外一些學者用實驗證明DA-9601[17]和1-cyano-2-hydroxy-3-butene（CHB）[18]誘導細胞凋亡也減輕了雨蛙肽誘導的胰腺炎嚴重程度。

　　由此可見，誘導調(diào)亡可能會降低胰腺炎的嚴重程度。盡管這些研究于動物實驗水平，但仍顯示出細胞凋亡用于胰腺炎臨床實踐的美好前景。相信隨著細胞凋亡的繼續(xù)深入研究，必將有助于揭示胰腺炎的發(fā)病機制，并有可能提高胰腺炎的診療水平。