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普通光學顯微鏡

發(fā)布時間： 2010/4/29　　點擊次數(shù)： 2414次

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詳細介紹：

普通光學顯微鏡是一種精密的光學儀器。以往zui簡單的顯微鏡僅由幾塊透鏡組成，而當前使用的顯微鏡由一套透鏡組成。普通光學顯微鏡通常能將物體放大1500—2000倍。

（一）顯微鏡的構造

普通光學顯微鏡的構造可分為兩大部分：一為機械裝置，一為光學系統(tǒng)，這兩部分很好的配合，才能發(fā)揮顯微鏡的作用。

1、顯微鏡的機械裝置

顯微鏡的機械裝置包括鏡座、鏡筒、物鏡轉換器、載物臺、推動器、粗動螺旋、微動螺旋等部件
（1）鏡座 鏡座是顯微鏡的基本支架，它由底座和鏡臂兩部分組成。在它上面連接有載物臺和鏡筒，它是用來安裝光學放大系統(tǒng)部件的基礎。
（2）鏡筒 鏡筒上接接目鏡，下接轉換器，形成接目鏡與接物鏡（裝在轉換器下）間的暗室。

從物鏡的后緣到鏡筒尾端的距離稱為機械筒長。因為物鏡的放大率是對一定的鏡筒長度而言的。鏡筒長度的變化，不僅放大倍率隨之變化，而且成像質量也受到影響。因此，使用顯微鏡時，不能任意改變鏡筒長度。上將顯微鏡的標準筒長定為160mm，此數(shù)字標在物鏡的外殼上。
（3）物鏡轉換器 物鏡轉換器上可安裝3—4個接物鏡，一般是三個接物鏡（低倍、高倍、油鏡）。Nikon顯微鏡裝有四個物鏡。轉動轉換器，可以按需要將其中的任何一個接物鏡和鏡筒接通，與鏡筒上面的接目鏡構成一個放大系統(tǒng)。
（4）載物臺 載物臺中央有一孔，為光線通路。在臺上裝有彈簧標本夾和推動器，其作用為固定或移動標本的位置，使得鏡檢對象恰好位于視野中心。
（5）推動器 是移動標本的機械裝置，它是由一橫一縱兩個推進齒軸的金屬架構成的，好的顯微鏡在縱橫架桿上刻有刻度標尺，構成很精密的平面座標系。如果我們須重復觀察已檢查標本的某一部分，在*次檢查時，可記下縱橫標尺的數(shù)值，以后按數(shù)值移動推動器，就可以找到原來標本的位置。
（6）粗動螺旋 粗動螺旋是移動鏡筒調節(jié)接物鏡和標本間距離的機件，老式顯微鏡粗螺旋向前扭，鏡頭下降接近標本。新近出產(chǎn)的顯微鏡（如Nikon顯微鏡）鏡檢時，右手向前扭載物臺上升，讓標本接近物鏡，反之則下降，標本脫離物鏡。
（7）微動螺旋 用粗動螺旋只可以粗放的調節(jié)焦距，要得到zui清晰的物象，需要用微動螺旋做進一步調節(jié)。微動螺旋每轉一圈鏡筒移動0.1毫米（100微米）。新近出產(chǎn)的較次的顯微鏡的粗動螺旋和微動螺旋是共軸的。

2、顯微鏡的光學系統(tǒng)

顯微鏡的光學系統(tǒng)由反光鏡，聚光器，接物鏡，接目鏡等組成，光學系統(tǒng)使物體放大，形成物體放大像。見圖1—2。
（1）反光鏡 較早的是用自然光檢視物體，在鏡座上裝有反光鏡。反光鏡是由一平面和另一凹面的鏡子組成，可以將投射在它上面的光線反射到聚光器透鏡的中央，照明標本。不用聚光器時用凹面鏡，凹面鏡能起會聚光線的作用。用聚光器時，一般都用平面鏡。新近出產(chǎn)的較次的顯微鏡鏡座上裝有光源，并有電流調節(jié)螺旋，可通過調節(jié)電流大小調節(jié)光照強度。
（2）聚光器 聚光器在載物臺下面，它是由聚光透鏡、虹彩光圈和升降螺旋組成的。聚光器可分為明視場聚光器和暗視場聚光器。配置的都是明視場聚光器，明視場聚光器有阿貝聚光器、齊明聚光器和搖出聚光器。阿貝聚光器在物鏡數(shù)值孔徑高于0.6時會顯示出色差和球差。齊明聚光器對色差、球差和慧差的校正程度很高，是明視場鏡檢中質量的聚光器，但它不適于4倍以下的物鏡。搖出聚光器能將聚光器上透鏡從光路中搖出滿足低倍物鏡（4×）大視場照明的需要。

聚光器安裝在載物臺下，其作用是將光源經(jīng)反光鏡反射來的光線聚焦于樣品上，以得到zui強的照明，使物象獲得明亮清晰的效果。聚光器的高低可以調節(jié)，使焦點落在被檢物體上，以得到zui大亮度。一般聚光器的焦點在其上方1.25mm處，而其上升限度為載物臺平面下方0.1mm。因此，要求使用的載玻片厚度應在0.8—1.2mm之間，否則被檢樣品不在焦點上，影響鏡檢效果。聚光器前透鏡組前面還裝有虹彩光圈，它可以開大和縮小，影響著成像的分辨力和反差，若將虹彩光圈開放過大，超過物鏡的數(shù)值孔徑時，便產(chǎn)生光斑；若收縮虹彩光圈過小，分辨力下降，反差增大。因此，在觀察時，通過虹彩光圈的調節(jié)再把視場光闌（帶有視場光闌的顯微鏡）開啟到視場周緣的外切處，使不在視場內的物體得不到任何光線的照明，以避免散射光的干擾。
（3）物鏡 安裝在鏡筒前端轉換器上的接物透鏡利用光線使被檢物體*次造像，物鏡成像的質量，對分辨力有著決定性的影響。物鏡的性能取決于物鏡的數(shù)值孔徑（numerical apeature簡寫為NA），每個物鏡的數(shù)值孔徑都標在物鏡的外殼上，數(shù)值孔徑越大，物鏡的性能越好。

物鏡的種類很多，可從不同角度來分類：

根據(jù)物鏡前透鏡與被檢物體之間的介質不同，可分為：

①干燥系物鏡以空氣為介質，如常用的40×以下的物鏡，數(shù)值孔徑均小于1。

②油浸系物鏡常以香柏油為介質，此物鏡又叫油鏡頭，其放大率為90×—100×，數(shù)值孔值大于1。

根據(jù)物鏡放大率的高低，可分為：

①低倍物鏡指1×—6×，NA值為0.04—0.15；

②中倍物鏡指6×—25×，NA值為0.15— 0.40；

③高倍物鏡指25×—63×，NA值為0.35—0.95；

④油浸物鏡指90×—100×，NA值為1.25—1.40。

根據(jù)物鏡像差校正的程度來分類可分為：

①消色差物鏡是zui常用的物鏡，外殼上標有“Ach”字樣，該物鏡可以除紅光和青光形成的色差。鏡檢時通常與惠更斯目鏡配合使用。

②復消色差物鏡物鏡外殼上標有“Apo”字樣，除能校正紅、藍、綠三色光的色差外，還能校正光造成的相差，通常與補償目鏡配合使用。

③特種物鏡在上述物鏡基礎上，為達到某些特定觀察效果而制造的物鏡。如：帶校正環(huán)物鏡，帶視場光闌物鏡，相差物鏡，熒光物鏡，無應變物鏡，無罩物鏡，長工作距離物鏡等。目前在研究中常用的物鏡還有：半復消色差物鏡（FL），平場物鏡（Plan），平場復消色差物鏡（Plan Apo）,超平場物鏡（Splan，超平場復消色差物鏡（Splan Apo）等。

（4）目鏡 目鏡的作用是把物鏡放大了的實像再放大一次，并把物像映入觀察者的眼中。目鏡的結構較物鏡簡單，的目鏡通常由兩塊透鏡組成，上端的一塊透鏡稱“接目鏡”，下端的透鏡稱“場鏡”。上下透鏡之間或在兩個透鏡的下方，裝有由金屬制的環(huán)狀光闌或叫“視場光闌”，物鏡放大后的中間像就落在視場光闌平面處，所以其上可安置目鏡測微尺。

常用的目鏡為惠更斯目鏡（Huygens eyepiece），如要進行研究用時，一般選用性能更好的目鏡，如補償目鏡（K）、平場目鏡（P）、廣視場目鏡（WF）。照相時選用照相目鏡（NFK）。

（二）光學顯微鏡的成像原理

顯微鏡的放大是通過透鏡來完成的，單透鏡成像具有像差，影響像質。由單透鏡組合而成的透鏡組相當于一個凸透鏡，放大作用更好。圖1—4是顯微鏡的成像原理模式。AB為標本

（三）顯微鏡的性能

顯微鏡分辨能力的高低決定于光學系統(tǒng)的各種條件。被觀察的物體必須放大率高，而且清晰，物體放大后，能否呈現(xiàn)清晰的細微結構，首先取決于物鏡的性能，其次為目鏡和聚光鏡的性能。
1、數(shù)值孔徑 也叫做鏡口率（或開口率），簡寫為N.A，在物鏡和聚光器上都標有它們的數(shù)值孔徑，數(shù)值孔徑是物鏡和聚光器的主要參數(shù)，也是判斷它們性能的zui重要指標。數(shù)值孔徑和顯微鏡的各種性能有密切的關系，它與顯微鏡的分辨力成正比，與焦深成反比，與鏡象亮度的平方根成正比。

數(shù)值孔徑可用下式表示：

N.A=n.sin	α
	2

式中：

n—物鏡與標本之間的介質析射率

α—物鏡的鏡口角

所謂鏡口角是指從物鏡光軸上的物點發(fā)出的光線與物鏡前透鏡有效直徑的邊緣所張的角度，見圖1—5。

鏡口角α總是小于180°。因為空氣的折射率為1，所以干燥物鏡的數(shù)值孔徑總是小于1，一般為0.05—0.95；油浸物鏡如用香柏油（折射率為1.515）浸沒，則數(shù)值孔徑zui大可接近1.5。雖然理論上數(shù)值孔徑的極限等于所用浸沒介質的折射率，但實際上從透鏡的制造技術看，是不可能達到這一極限的。通常在實用范圍內，油浸物鏡的zui大數(shù)值孔徑是1.4。

幾種物質的介質的折射率如下：

空氣為1.0，水為1.33，玻璃為1.5，甘油為1.47，香柏油為1.52。

介質折射率對物鏡光線通路的影響見圖1—6。
2、分辨力

D可用下式表示：

D=λ/2N.A.

可見光的波長為0.4—0.7微米，平均波長為0.55微米。若用數(shù)值孔為0.65的物鏡，則D=0.55微米/2×0.65=0.42微米。這表示被檢物體在0.42微米以上時可被觀察到，若小于0.42微米就不能視見。如果使用數(shù)值孔徑為1.25的物鏡，則D=2.20微米。凡被檢物體長度大于這個數(shù)值，均能視見。由此可見，D值愈小，分辨力愈高，物象愈清楚。根據(jù)上式，可通過：（1）減低波長；（2）增大折射率；（3）加大鏡口角來提高分辨力。紫外線作光源的顯微鏡和電子顯微鏡就是利用短光波來提高分辨力以檢視較小的物體的。物鏡分辨力的高低與造象是否清楚有密切的關系。目鏡沒有這種性能。目鏡只放大物鏡所造的象。
3、放大率：

顯微鏡放大物體，首先經(jīng)過物鏡*次放大造象，目鏡在明視距離造成第二次放大象。放大率就是zui后的象和原物體兩者體積大小之比例。因此，顯微鏡的放大率（V）等于物鏡放大率（V₁）和目鏡放大率（V₂）的乘積，即：

V=V₁×V₂

比較的計算方法，可從下列公式求得

M=	△	×	D
	F₁		F₂

F₁=接物鏡焦距，F(xiàn)₂=接目鏡焦距 △=光學筒長，D=明視距離（=250毫米）

△	=接物鏡的放大倍數(shù)	D	=接目鏡放大倍數(shù)	M=顯微鏡放大倍數(shù)
F₁		F₂

設△=160毫米 F₁=4毫米 D=250毫米 F₂=150毫米

則M=	△	×	D	=	160	×	250	=40×16.7=668倍
	F₁		F₂		4		15

4、焦深：

在顯微鏡下觀察一個標本時，焦點對在某一象面時，物象zui清晰，這象面為目的面。在視野內除目的面外，還能在目的面的上面和下面看見模糊的物象，這兩個面之間的距離稱為焦深。物鏡的焦深和數(shù)值孔徑及放大率成反比：即數(shù)值孔徑和放大率愈大，焦深愈小。因此調節(jié)油鏡比調節(jié)低倍鏡要更加仔細，否則容易使物象滑過而找不到。
二、顯微鏡的使用操作及注意事項

顯微鏡結構精密，使用時必須細心，要按下述操作步驟進行。

（一）觀察前的準備

1、顯微鏡從顯微鏡柜或鏡箱內拿出時，要用右手緊握鏡臂，左手托住鏡座，平穩(wěn)地將顯微鏡搬運到實驗桌上。

2、將顯微鏡放在自己身體的左前方，離桌子邊緣約10cm左右，右側可放記錄本或繪圖紙。

3、調節(jié)光照不帶光源的顯微鏡，可利用燈光或自然光通過反光鏡來調節(jié)光照，但不能用直射陽光，直射陽光會影響物像的清晰并刺激眼睛。

將10×物鏡轉入光孔，將聚光器上的虹彩光圈打開到zui大位置，用左眼觀察目鏡中視野的亮度，轉動反光鏡，使視野的光照達到zui明亮zui均勻為止。光線較強時，用平面反光鏡，光線較弱時，用凹面反光鏡。自帶光源的顯微鏡，可通過調節(jié)電流旋鈕來調節(jié)光照強弱。

4、調節(jié)光軸中心顯微鏡在觀察時，其光學系統(tǒng)中的光源、聚光器、物鏡和目鏡的光軸及光闌的中心必須跟顯微鏡的光軸同在一直線上。帶視場光闌的顯微鏡，先將光闌縮小，用10×物鏡觀察，在視場內可見到視場光闌圓球多邊形的輪廓像，如此像不在視場中央，可利用聚光器外側的兩個調整旋鈕將其調到中央，然后緩慢地將視場光闌打開，能看到光束向視場周緣均勻展開直至視場光闌的輪廓像*與視場邊緣內接，說明光線已經(jīng)合軸。

（二）低倍鏡觀察 鏡檢任何標本都要養(yǎng)成必須先用低倍鏡觀察的習慣。因為低倍鏡視野較大，易于發(fā)現(xiàn)目標和確定檢查的位置。

將標本片放置在載物臺上，用標本夾夾住，移動推動器，使被觀察的標本處在物鏡正下方，轉動粗調節(jié)旋鈕，使物鏡調至接近標本處，用目鏡觀察并同時用粗調節(jié)旋鈕慢慢升起鏡筒（或下降載物臺），直至物像出現(xiàn)，再用細調節(jié)旋鈕使物像清晰為止。用推動器移動標本片，找到合適的目的像并將它移到視野中央進行觀察。

（三）高倍鏡觀察 在低倍物鏡觀察的基礎上轉換高倍物鏡。較好的顯微鏡，低倍、高倍鏡頭是同焦的，在正常情況下，高倍物鏡的轉換不應碰到載玻片或其上的蓋玻片。若使用不同型號的物鏡，在轉換物鏡時要從側面觀察，避免鏡頭與玻片相撞。然后從目鏡觀察，調節(jié)光照，使亮度適中，緩慢調節(jié)粗調節(jié)旋鈕，使載物臺上升（或鏡筒下降），直至物像出現(xiàn)，再用細調節(jié)旋鈕調至物像清晰為止，找到需觀察的部位，并移至視野中央進行觀察。

（四）油鏡觀察 油浸物鏡的工作距離（指物鏡前透鏡的表面到被檢物體之間的距離）很短，一般在0.2mm以內，再加上一般光學顯微鏡的油浸物鏡沒有“彈簧裝置”，因此使用油浸物鏡時要特別細心，避免由于“調焦”不慎而壓碎標本片并使物鏡受損。

使用油鏡按下列步驟操作：

1、先用粗調節(jié)旋鈕將鏡筒提升（或將載物臺下降）約2cm，并將高倍鏡轉出。

2、在玻片標本的鏡檢部位滴上一滴香柏油。

3、從側面注視，用粗調節(jié)旋鈕將載物臺緩緩地上升，（或鏡筒下降），使油浸物鏡浸入香柏油中，使鏡頭幾乎與標本接觸。

4、從接目鏡內觀察，放大視場光闌及聚光鏡上的虹彩光圈（帶視場光闌油鏡開大視場光闌），上調聚光器，使光線充分照明。用粗調節(jié)旋鈕將載物臺徐徐下降（或鏡筒上升），當出現(xiàn)物像一閃后改用細調節(jié)旋鈕調至zui清晰為止。如油鏡已離開油面而仍未見到物象，必須再從側面觀察，重復上述操作。

5、觀察完畢，下降載物臺，將油鏡頭轉出，先用擦鏡紙擦去鏡頭上的油，再用擦鏡紙蘸少許乙醚酒精混合液（乙醚2份，純酒精3份）或二甲苯，擦去鏡頭上殘留油跡，zui后再用擦鏡紙擦拭2—3下即可，（注意向一個方向擦拭）。

6、將各部分還原，轉動物鏡轉換器，使物鏡頭不與載物臺通光孔相對，而是成八字形位置，再將鏡筒下降至zui低，降下聚光器，反光鏡與聚光器垂直，用一個干凈手帕將接目鏡罩好，以免目鏡頭沾污灰塵。zui后用柔軟紗布清潔載物臺等機械部分，然后將顯微鏡放回柜內或鏡箱中。

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