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PPM1A蛋白的表達(dá)純化及鼠多克隆抗體制備研究——2
發(fā)布時(shí)間： 2010-07-28 點(diǎn)擊次數(shù)： 2382次2.1 目的蛋白的表達(dá) SDS2PAGE電泳可見,pBEX2PPM1A2His經(jīng)IPTG誘導(dǎo)2、4h后在大腸桿菌中均有表達(dá),4h時(shí)獲得量zui大,空菌誘導(dǎo)4h僅有較弱條帶。且PPM1A的產(chǎn)量隨IPTG的濃度加大變化不大.
2.2 目的蛋白的純化和復(fù)性 誘導(dǎo)后的菌體處理后經(jīng)超速離心,SDS2PAGE電泳發(fā)現(xiàn)大部分目的蛋白存在于沉淀中,主要以包涵體形式存在。用Ni2NTA純化試劑盒處理所得的目的蛋白純度達(dá)90%,質(zhì)量濃度為2.45mg/mL,復(fù)性后目的蛋白質(zhì)量濃度為1.15mg/mL。
2.3 目的蛋白的Western2blot鑒定 空菌組無明顯條帶,誘導(dǎo)菌組可見較強(qiáng)條帶,提示IPTG誘導(dǎo)后所得的蛋白為目的蛋白。
2.4 多克隆抗體滴度檢測 純化的PPM1A重組蛋白0.1g/mL每孔100L包被,ELISA法測得的抗體滴度達(dá)到1∶100000。
2.5 多克隆抗體的特異性檢測 PPM1A多克隆抗體1∶800作為*抗體,用Envision免疫組化法檢測肝癌組織Edmondson病理分級(jí)Ⅰ級(jí)中PPM1A的表達(dá),同時(shí)用PPM1A鼠單克隆抗體和正常小鼠血清分別為陽性對(duì)照和陰性對(duì)照為*抗體檢測,結(jié)果可見PPM1A多克隆抗體組和PPM1A鼠單克隆抗體陽性對(duì)照組的肝細(xì)胞胞核和胞漿明顯陽性表達(dá),而正常小鼠血清組則無著色;另也用免疫熒光法檢測HepG2細(xì)胞中PPM1A的表達(dá),PPM1A多克隆抗體1∶50組細(xì)胞的胞核陽性著色,正常小鼠血清組則未見明顯熒光。
3 討論
PPM1A蛋白磷酸酶1A（以前2C）（PP2CA;MGC9201;PP2C2ALPHA是一種抑癌基因,定位于染色體14q23.1,47604bp,屬于絲/蘇蛋白磷酸酶的PP2C家族,為一常見的鎂或錳離子依賴的去磷酸化酶,定位于胞漿和核,使MAP激酶和MAPK激酶去磷酸化而起負(fù)調(diào)節(jié)作用;能使細(xì)胞周期蛋白依賴的激酶去磷酸化,參與細(xì)胞周期的調(diào)控;可抑制環(huán)境應(yīng)激反應(yīng)誘導(dǎo)的p38和JNK激酶級(jí)聯(lián)作用;其過量表達(dá)可激活抑癌基因TP53/p53的表達(dá),導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯于G/M期和引起細(xì)胞凋亡,從而可能參與腫瘤的發(fā)生機(jī)制調(diào)節(jié)。
TGF2家族成員廣泛存在于從果蠅到人類的多種生物的各種組織中,控制多種正常細(xì)胞的發(fā)育過程,參與一些癌癥、自身免疫疾病和纖維化疾病的發(fā)生發(fā)展。TGF2信號(hào)通路的應(yīng)答中一個(gè)關(guān)鍵的步驟就是Smad2被TGF2受體II磷酸化后與Smad3,Smad4形成復(fù)合體,移位細(xì)胞核中,與序列特異的DNA結(jié)合蛋白CRB/P300等結(jié)合,啟動(dòng)TGF2通路,激活特定的靶基因。Xu等人研究認(rèn)為Smad2的磷酸化與去磷酸化對(duì)TGF2信號(hào)通路的調(diào)節(jié)起重要作用,而近期發(fā)現(xiàn)PPM1A就是那種特異的去磷酸化酶,促進(jìn)核中Smads的去磷酸而轉(zhuǎn)移出核,PPM1A的異常表達(dá)會(huì)消除TGF2誘導(dǎo)的抗增生核轉(zhuǎn)錄反應(yīng),但是刪除PPM1A會(huì)使哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的TGF2號(hào)途徑活性增高。資料顯示TGF2/Smads通路是肝臟細(xì)胞生長的一個(gè)重要調(diào)節(jié)因子,參與肝細(xì)胞的生長、分化、黏附、轉(zhuǎn)移、細(xì)胞外基質(zhì)的形成及免疫調(diào)節(jié)等,肝癌組織中磷酸化Smad2核聚集可與肝臟腫瘤的惡性程度密切相關(guān)。故而,進(jìn)一步深入研究肝組織中PPM1A的功能有深遠(yuǎn)意義。
該試驗(yàn)中,我們利用制備的PPM1A鼠多克隆抗體,采用免疫組化法檢測肝癌組織中PPM1A的表達(dá),顯示其結(jié)果與用PPM1A單克隆抗體檢測相似,用免疫熒光法檢測了HepG2細(xì)胞中的PPM1A的表達(dá)主要定位于胞核,與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果一致示了PPM1A鼠多克隆抗體能特異地檢測肝組織中PPM1A的表達(dá),為下一步深入研究肝細(xì)胞中PPM1A的功能以及與TGF信號(hào)通路的對(duì)肝癌發(fā)生的影響等研究打下了基礎(chǔ),為尋找新的治療策略提供了參考資料。
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