口蹄疫酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）

1979年Crowther建立了間接夾心ELISA，ELISA試驗(yàn)是當(dāng)前應(yīng)用zui廣的一種免疫測(cè)定方法，它是以物理方法將抗體（或抗原）吸附在固相載體上，隨后的一系列免疫學(xué)反應(yīng)和生物化學(xué)反應(yīng)都在此固相載體上進(jìn)行的免疫酶測(cè)定試驗(yàn)，包括間接法、雙抗體夾心法和競(jìng)爭(zhēng)法以及近年來(lái)發(fā)展的一些改良法。1989年被歐洲FMD防制委員會(huì)推薦廣泛使用，成為認(rèn)可的一種標(biāo)準(zhǔn)化診斷技術(shù)。

近年來(lái)，ELISA已先后用于FMD病原和血清樣品的診斷并逐步代替補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)以及中和試驗(yàn)。這項(xiàng)技術(shù)快速、敏感、準(zhǔn)確，用滅活的140S制備抗血清或作抗原，可在一般的實(shí)驗(yàn)室操作，還可制成方便的診斷試劑盒。檢測(cè)田間樣品時(shí)ELISA的敏感性高于補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)；對(duì)于含量較高的樣品，例如新鮮的水皰皮和細(xì)胞培養(yǎng)物，可在2—4h內(nèi)獲得結(jié)果，應(yīng)用預(yù)先在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)包被的免疫反應(yīng)板以及凍干劑，將更便于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。

2004年G．丸Paiba等應(yīng)用固相競(jìng)爭(zhēng)ELISA（SPCE）對(duì)綿羊、山羊和豬分別進(jìn)行了O型FMD血清學(xué)抗體檢測(cè)，并對(duì)效果進(jìn)行了比較。試驗(yàn)對(duì)2001年英國(guó)暴發(fā)FMD其間的267頭綿羊和143頭豬分別進(jìn)行VNT和SPCE檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)SPCE較VNT能夠檢測(cè)出更多的陽(yáng)性結(jié)果。2001年英國(guó)FMD暴發(fā)期間大規(guī)模的血清學(xué)調(diào)查已充分證實(shí)了SPCE方法的靈敏性、可施行性和可重復(fù)性。同時(shí)田間血清學(xué)試驗(yàn)和實(shí)驗(yàn)室血清學(xué)實(shí)驗(yàn)也同樣表明與VNT相比，SPCE方法的敏感性很少因病毒毒株的不同而受影響。

以ELISA為基礎(chǔ)的檢測(cè)方法，有許多客觀(guān)的*性，敏感性相對(duì)較高且適合于大規(guī)模的血清學(xué)調(diào)查，F(xiàn)MDV非結(jié)構(gòu)蛋白特異性抗體會(huì)存在于FMDV持續(xù)感染、短期感染、間歇性感染的豬體，因此FMDV非結(jié)構(gòu)蛋抗體檢測(cè)試劑盒已經(jīng)被研制。我國(guó)中國(guó)臺(tái)灣省已經(jīng)開(kāi)始使用NSP抗體檢測(cè)ELISA試劑盒。ELISA同時(shí)也存在著弊端，2004年Fan Lee等對(duì)三種FMDV非結(jié)構(gòu)蛋抗體檢測(cè)試劑盒（CHEKIT FMD—3ABC、UBI FMD NS EIA和DVIVRNSPELISA）檢測(cè)效果進(jìn)行了對(duì)比研究。這些FMDV非結(jié)構(gòu)蛋白抗體檢測(cè)試劑盒被分別應(yīng)用于健康豬、感染豬和疫苗免疫過(guò)的豬，并對(duì)試劑盒的特異性與靈敏度進(jìn)行了檢測(cè)。表明特定的三種FMDV非結(jié)構(gòu)蛋白抗體檢測(cè)試劑盒都很難將感染病畜與已康復(fù)牲畜區(qū)分開(kāi)，這給檢測(cè)工作帶來(lái)了較大的困難。

①間接夾心ELISA。間接夾心ELISA是目前OIE FAO（聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織）的FMD—WRI。（世界參考實(shí)驗(yàn)室）確認(rèn)的檢測(cè)FMDV抗原和病毒血清型的方法。該法采用典型的雙抗夾心ELISA操作方式，在ELISA多孔板的不同排部分用型特異兔抗FMD病毒幾個(gè)血清型的抗血清（捕獲抗體）包被，于各孔加入被檢樣品懸液，并設(shè)強(qiáng)陽(yáng)性、弱陽(yáng)性、陰性和空白對(duì)照，再加每個(gè)FMDV型特異的豚鼠抗血清（檢測(cè)抗體），隨后，加酶標(biāo)記的羊抗豚鼠血清（交聯(lián)劑）。每一步都應(yīng)充分洗滌未結(jié)合的試劑。加酶底物后，出現(xiàn)顏色反應(yīng)時(shí)可判為陽(yáng)性反應(yīng)，強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)時(shí)，肉眼即可判定。也可用酶標(biāo)讀板儀在適當(dāng)?shù)牟ㄩL(zhǎng)內(nèi)讀取結(jié)果，在這種情況下，光吸收值比背景大o．1以上即可判為陽(yáng)性反應(yīng)，可定出相應(yīng)的血清型。光吸收值接近o．1時(shí)，應(yīng)重復(fù)做或用組織培養(yǎng)物傳代擴(kuò)增抗原，當(dāng)出現(xiàn)CPE時(shí)，檢測(cè)上清液。間接夾心ELISA用于FMD的檢測(cè)和定型時(shí)，特異性與CFT相同，靈敏度更高，且節(jié)省試劑，重復(fù)性好，加之與連接計(jì)算機(jī)的酶標(biāo)儀可使操作自動(dòng)化，判讀結(jié)果更準(zhǔn)確，在接到待檢樣品后4～5h即可出結(jié)果。對(duì)于FMD的檢測(cè)和定型及制定FMD的防治計(jì)劃，有著十分重要的意義。

②液相阻斷夾心ELISA。1986年Hamblin等的液相封閉ELISA（LPBE）問(wèn)世，該法是將各型已知量的病毒與2倍連續(xù)稀釋的被檢血清混合37~C振蕩lh后轉(zhuǎn)入4~C濕盒作用，使之充分結(jié)合。待檢血清中若含有某型抗體，必然與同型病毒抗原結(jié)合。試驗(yàn)時(shí)將上述混合液轉(zhuǎn)入已用各型相應(yīng)捕獲抗體包被好的ELISA板中，之后依次加入檢測(cè)抗體、交聯(lián)劑、底物和終止液，zui后用酶標(biāo)儀判讀結(jié)果。若有未結(jié)合的抗原，必然會(huì)與捕獲抗體結(jié)合。形成的復(fù)合物與隨后的檢測(cè)抗體作用，zui后按試驗(yàn)孔呈現(xiàn)顏色與抗原對(duì)照（末加血清）孔呈現(xiàn)的顏色相比判定結(jié)果。顏色的深淺和抗體的含量呈負(fù)相關(guān)，即顏色越深，被檢血清中的抗體含量越少。當(dāng)被檢樣品的OD（光學(xué)密度）值小于或等于對(duì)照抗原OD值的50％時(shí)，該樣品判定為陽(yáng)性，血清抗體效價(jià)以產(chǎn)生相當(dāng)于50％抗原對(duì)照平均值的血清zui終稀釋度表示。其抗體效價(jià)1；40相當(dāng)于VNT效價(jià)1：16（VNT檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)是抗體效價(jià)在1：16以下為陰性）。該方法尤其適合于大批樣品的血清學(xué)調(diào)查。彌補(bǔ)了VNT的不足，由于VNT方法易產(chǎn)生假陽(yáng)性反應(yīng)，需要有一定的技能來(lái)產(chǎn)生重復(fù)性的結(jié)果，因此ELISA方法已經(jīng)被*大量的實(shí)驗(yàn)室采納作為疫病監(jiān)測(cè)方法。對(duì)于FMD血清抗體的監(jiān)測(cè)具有廣闊的應(yīng)用前景。